Le venin de serpent contient des enzymes qui hydrolysent les liaisons esters carboxyliques.Les substrats d'hydrolyse sont les phospholipides, l'acétylcholine et l'acétate aromatique.Ces enzymes comprennent trois types : la phospholipase, l'acétylcholinestérase et l'estérase aromatique.L'arginine estérase dans le venin de serpent peut également hydrolyser l'arginine ou la lysine synthétique, mais elle hydrolyse principalement les liaisons peptidiques protéiques dans la nature, elle appartient donc à la protéase.Les enzymes discutées ici n'agissent que sur des substrats d'ester et ne peuvent agir sur aucune liaison peptidique.Parmi ces enzymes, les fonctions biologiques de l'acétylcholinestérase et de la phospholipase sont plus importantes et ont été pleinement étudiées.Certains venins de serpent ont une forte activité d'estérase aromatique, qui peut hydrolyser l'ester éthylique de p-nitrophényle, l'acétate de a- ou P-naphtalène et l'ester éthylique d'indole.On ne sait toujours pas si cette activité est produite par une enzyme indépendante ou un effet secondaire connu de la carboxylestérase, sans parler de sa signification biologique.Lorsque le venin d'Agkistrodon halys Japonicus a été mis à réagir avec de l'ester éthylique de p-nitrophényle et de l'ester éthylique d'indole, les hydrolysats de p-nitrophénol et d'indole phénol n'ont pas été trouvés;Au contraire, si ces esters réagissent avec le venin de serpent de la sous-espèce cobra Zhoushan et le venin de serpent Bungarus multicinctus, ils seront rapidement hydrolysés.On sait que ces venins de cobra ont une forte activité cholinestérase, qui peut être responsable de l'hydrolyse des substrats ci-dessus.En fait, Mclean et al.(1971) ont rapporté que de nombreux venins de serpent appartenant à la famille Cobra peuvent hydrolyser l'ester éthylique d'indole, l'ester éthylique de naphtalène et l'ester butylnaphtalène.Ces venins de serpent proviennent de: cobra, cobra à cou noir, cobra à lèvres noires, cobra doré, cobra égyptien, cobra royal, mamba cobra doré, mamba noir et mamba à lèvres blanches (D. aw connaît encore le serpent à sonnette rhombola
Le venin de serpent peut hydrolyser l'ester éthylique de méthylindole, qui est le substrat pour déterminer l'activité de la cholinestérase dans le sérum, mais ce venin de serpent ne montre pas d'activité de la cholinestérase.Cela montre qu'il existe une estérase inconnue dans le venin de cobra, qui est différente de la cholinestérase.Pour comprendre la nature de cette enzyme, d'autres travaux de séparation sont nécessaires.
1、 Phospholipase A2
(I) Aperçu
La phospholipase est une enzyme capable d'hydrolyser le phosphate de glycéryle.Il existe 5 types de phospholipase dans la nature, à savoir la phospholipase A2 et la phospholipase
A. , phospholipase B, phospholipase C et phospholipase D. Le venin de serpent contient principalement de la phospholipase A2 (PLA2), quelques venins de serpent contiennent de la phospholipase B et d'autres phospholipases se trouvent principalement dans les tissus animaux et les bactéries.La figure 3-11-4 montre le site d'action de ces phospholipases sur l'hydrolyse du substrat.
Parmi les phospholipases, la PLA2 a été davantage étudiée.C'est peut-être l'enzyme la plus étudiée dans le venin de serpent.Son substrat est la liaison ester sur la deuxième position du Sn-3-glycérophosphate.Cette enzyme est largement présente dans le venin de serpent, le venin d'abeille, le venin de scorpion et les tissus animaux, et la PLA2 est abondante dans quatre familles de venins de serpent.Parce que cette enzyme décompose les globules rouges et provoque une hémolyse, elle est aussi appelée « hémolysine ».Certaines personnes appellent également PLA2 lécithinase hémolytique.
Ludeeke a d'abord découvert que le venin de serpent peut produire un composé hémolytique en agissant sur la lécithine par le biais d'enzymes.Plus tard, Delezenne et al.a prouvé que lorsque le venin de cobra agit sur le sérum ou le jaune de cheval, il forme une substance hémolytique.On sait maintenant que la PLA2 peut agir directement sur les phospholipides de la membrane érythrocytaire, détruisant la structure de la membrane érythrocytaire et provoquant une hémolyse directe ;Il peut également agir sur le sérum ou la lécithine ajoutée pour produire de la lécithine hémolytique, qui agit sur les globules rouges pour produire une hémolyse indirecte.Bien que la PLA2 soit abondante dans les quatre familles de venins de serpent, la teneur en enzymes de divers venins de serpent est légèrement différente.Crotale (C
Le venin de serpent n'a montré qu'une faible activité PLA2.Le tableau 3-11-11 illustre la comparaison de l'activité PLA2 de 10 venins majeurs de serpents venimeux en Chine.
Tableau 3-11-11 Comparaison des activités phospholipase VIII de 10 venins de serpent en Chine
Venin de serpent
Libération de graisse
Acide aliphatique,
Cjumol/mg)
Activité hémolytique CHU50/^ g * ml)
Venin de serpent
Libérer les acides gras
(^raol/mg)
Activité hémolytique "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
onze
Ophis micracéphale
cinq virgule un zéro
kalyspallas
8. 68
deux mille huit cents
gracile
V, aigu
7. 56
* * #
Ophiophage hannah
trois virgule huit deux
cent quarante
Bnugarus fasctatus
7,56
deux cent quatre vingt
B. multicinctus
un virgule neuf six
deux cent quatre vingt
Vipère à russelli
sept virgule zéro trois
T, mucrosquamatus
un virgule huit cinq
siamois
T. stejnegeri
0. 97
(2) Séparation et purification
Le contenu de PLA2 dans le venin de serpent est important et il est stable à la chaleur, aux acides, aux alcalis et aux dénaturants, de sorte qu'il est facile de purifier et de séparer le PLA2.La méthode courante consiste à effectuer d'abord une filtration sur gel sur le venin brut, puis à effectuer une chromatographie par échange d'ions, et l'étape suivante peut être répétée.Il convient de noter que la lyophilisation du PLA2 après chromatographie par échange d'ions ne doit pas provoquer d'agrégation, car le processus de lyophilisation augmente souvent la force ionique dans le système, ce qui est un facteur important provoquant l'agrégation du PLA2.En plus des méthodes générales ci-dessus, les méthodes suivantes ont également été adoptées : ① Wells et al.② L'analogue de substrat de PLA2 a été utilisé comme ligand pour la chromatographie d'affinité.Ce ligand peut se lier à PLA2 dans le venin de serpent avec Ca2+.L'EDTA est principalement utilisé comme éluant.Après l'élimination de Ca2+, l'affinité entre la PLA2 et le ligand diminue et elle peut être dissociée du ligand.D'autres utilisent une solution organique à 30 % ou de l'urée à 6 mol/L comme éluant.③ Une chromatographie hydrophobe a été réalisée avec PheiiylSephar0SeCL-4B pour éliminer les traces de PLA2 dans la cardiotoxine.④ L'anticorps anti PLA2 a été utilisé comme ligand pour effectuer une chromatographie d'affinité sur PLA2.
Jusqu'à présent, un grand nombre de PLAZ de venin de serpent ont été purifiés.Tu et al.(1977) ont répertorié le PLA2 purifié à partir de venin de serpent avant 1975. Ces dernières années, un grand nombre d'articles sur la séparation et la purification du PLA2 ont été rapportés chaque année.Ici, nous nous concentrons sur la séparation et la purification du PLA par les chercheurs chinois.
Chen Yuancong et al.(1981) ont séparé trois espèces de PLA2 du venin d'Agkistrodon halys Pallas dans le Zhejiang, qui peuvent être divisés en PLA2 acide, neutre et alcalin selon leurs points isoélectriques.Selon sa toxicité, la PLA2 neutre est plus toxique, qui a été identifiée comme la neurotoxine présynaptique Agkistrodotoxine.Le PLA2 alcalin est moins toxique et le PLA2 acide n'a presque aucune toxicité.Wu Xiangfu et al.(1984) ont comparé les caractéristiques de trois PLA2, notamment le poids moléculaire, la composition en acides aminés, le N-terminal, le point isoélectrique, la stabilité thermique, l'activité enzymatique, la toxicité et l'activité hémolytique.Les résultats ont montré qu'ils avaient un poids moléculaire et une stabilité thermique similaires, mais présentaient des différences significatives dans d'autres aspects.Du point de vue de l'activité enzymatique, l'activité enzymatique acide était supérieure à l'activité enzymatique alcaline ;L'effet hémolytique de l'enzyme alcaline sur les globules rouges du rat était le plus fort, suivi de l'enzyme neutre et de l'enzyme acide à peine hémolysée.Par conséquent, on suppose que l'effet hémolytique de PLAZ est lié à la charge de la molécule PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) ont fabriqué des cristaux d'Agkistrodotoxine.Tu Guangliang et al.(1983) ont rapporté qu'un PLA toxique avec un point isoélectrique de 7,6 a été isolé et purifié à partir du venin de Vipera rotundus du Fujian, et ses propriétés physiques et chimiques, sa composition en acides aminés et la séquence de 22 résidus d'acides aminés au N -terminal ont été déterminés.Li Yuesheng et al.(1985) ont isolé et purifié une autre PLA2 du venin de Viper rotundus dans le Fujian.La sous-unité de la PLA2 * est de 13 800, le point isoélectrique est de 10,4 et l'activité spécifique est de 35/xnioI/miri mg。 Avec la lécithine comme substrat, le pH optimal de l'enzyme est de 8,0 et la température optimale est de 65 ° C LD5 injectée par voie intraveineuse chez la souris.Elle est de 0,5 ± 0,12 mg/kg.Cette enzyme a des effets anticoagulants et hémolytiques évidents.La molécule toxique PLA2 se compose de 123 résidus de 18 types d'acides aminés.La molécule est riche en cystéine (14), en acide aspartique (14) et en glycine (12), mais ne contient qu'une seule méthionine, et son N-terminal est un résidu sérine.Comparé au PLA2 isolé par Tuguang, le poids moléculaire et le nombre de résidus d'acides aminés des deux isoenzymes sont très similaires, et la composition en acides aminés est également très similaire, mais le nombre de résidus d'acide aspartique et de proline est quelque peu différent.Le venin de serpent King Cobra du Guangxi contient du PLA2 riche.Shu Yuyan et al.(1989) ont isolé une PLA2 du venin, qui a une activité spécifique 3,6 fois plus élevée que le venin d'origine, un poids moléculaire de 13000, une composition de 122 résidus d'acides aminés, un point isoélectrique de 8,9 et une bonne stabilité thermique.D'après l'observation au microscope électronique de l'effet du PLA2 basique sur les globules rouges, on peut voir qu'il a un effet évident sur la membrane des globules rouges humains, mais n'a aucun effet évident sur les globules rouges de chèvre.Cette PLA2 a un effet de retardement évident sur la vitesse électrophorétique des globules rouges chez l'homme, la chèvre, le lapin et le cobaye.Chen et al.Cette enzyme peut inhiber l'agrégation plaquettaire induite par l'ADP, le collagène et l'acide arachidonique de sodium.Lorsque la concentration de PLA2 est de 10/xg/ml ~ 100 jug/ml, l'agrégation plaquettaire est complètement inhibée.Si des plaquettes lavées étaient utilisées comme matériaux, la PLA2 ne pourrait pas inhiber l'agrégation à la concentration de 20 mg/ml.L'aspirine est un inhibiteur de la cyclooxygénase, qui peut inhiber l'effet de la PLA2 sur les plaquettes.La PLA2 peut inhiber l'agrégation plaquettaire en hydrolysant l'acide arachidonique pour synthétiser le thromboxane A2.La conformation en solution de PLA2 produite par le venin d'Agkistrodon halys Pallas dans la province du Zhejiang a été étudiée au moyen du dichroïsme circulaire, de la fluorescence et de l'absorption UV.Les résultats expérimentaux ont montré que la conformation de la chaîne principale de cette enzyme était similaire à celle du même type d'enzyme d'autres espèces et genres, la conformation du squelette avait une bonne résistance à la chaleur et le changement structurel dans l'environnement acide était réversible.La combinaison de l'activateur Ca2+ et de l'enzyme n'affecte pas l'environnement des résidus de tryptophane, tandis que l'inhibiteur Zn2+ fait le contraire.La manière dont la valeur du pH de la solution affecte l'activité enzymatique est différente des réactifs ci-dessus.
Dans le processus de purification PLA2 du venin de serpent, un phénomène évident est qu'un venin de serpent contient deux pics d'élution PLA2 ou plus.Ce phénomène peut s'expliquer comme suit : ① en raison de l'existence d'isoenzymes ;② Un type de PLA2 est polymérisé en une variété de mélanges de PLA2 avec différents poids moléculaires, dont la plupart se situent entre 9 000 et 40 000 ;③ La combinaison de PLA2 et d'autres composants de venin de serpent complique PLA2 ;④ La liaison amide du PLA2 étant hydrolysée, la charge change.① et ② sont courants, à quelques exceptions près, comme PLA2 dans le venin de serpent CrWa/w
Il existe deux situations : ① et ②.La troisième condition a été trouvée dans PLA2 dans le venin des serpents suivants : Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, vipère palestinienne, vipère des sables et terrible crotale km。
Le résultat du cas ④ fait changer la vitesse de migration de PLA2 pendant l'électrophorèse, mais la composition en acides aminés ne change pas.Les peptides peuvent être rompus par hydrolyse, mais généralement ils sont toujours liés par des liaisons disulfure.Le venin du crotale des fosses orientales contient deux formes de PLA2, appelées PLA2 de type a et de type p respectivement.La différence entre ces deux types de PLA2 est un seul acide aminé, c'est-à-dire que la glutamine dans une molécule de PLA2 est remplacée par l'acide glutamique dans l'autre molécule de PLA2.Bien que la raison exacte de cette différence ne soit pas claire, on pense généralement qu'elle est liée à la désamination de PLA2.Si le PLA2 dans le venin de vipère palestinienne est maintenu au chaud avec le venin brut, les groupes terminaux de ses molécules enzymatiques deviendront plus nombreux qu'auparavant.Du C PLA2 isolé du venin de serpent a deux N-terminaux différents et son poids moléculaire est de 30000. Ce phénomène peut être causé par le dimère asymétrique de PLA2, qui est similaire au dimère symétrique formé par PLA2 dans le venin du serpent à sonnettes à dos de diamant oriental et le crotale à dos de diamant de l'Ouest.Le cobra asiatique est composé de nombreuses sous-espèces, dont certaines ne sont pas très précises dans la classification.Par exemple, ce qu'on appelait autrefois la sous-espèce Cobra Outer Caspian est maintenant reconnue
Il devrait être attribué au cobra de la mer Caspienne extérieure.Comme il existe de nombreuses sous-espèces et qu'elles sont mélangées, la composition du venin de serpent varie considérablement en raison de différentes sources, et la teneur en isoenzymes PLA2 est également élevée.Par exemple, le venin de cobra
Au moins 9 types d'isoenzymes PLA2 d'espèces r ^ ll ont été trouvés dans, et 7 types d'isoenzymes PLA2 ont été trouvés dans le venin de la sous-espèce de cobra Caspian.Durkin et al.(1981) ont étudié la teneur en PLA2 et le nombre d'isoenzymes dans différents venins de serpent, dont 18 venins de cobra, 3 venins de mamba, 5 venins de vipère, 16 venins de crotale et 3 venins de serpent marin.En général, l'activité PLA2 du venin de cobra est élevée, avec de nombreuses isozymes.L'activité PLA2 et les isozymes du venin de vipère sont moyennes.L'activité PLA2 du venin de mamba et du venin de serpent à sonnette est très faible ou nulle.L'activité PLA2 du venin de serpent de mer est également faible.
Ces dernières années, il n'a pas été signalé que la PLA2 dans le venin de serpent existe sous forme de dimère actif, comme le crotale rhombophore oriental (le venin de serpent C. contient de la PLA2 de type a et de type P, toutes deux composées de deux sous-unités identiques , et seule la dimérase a
Activité.Shen et al.ont également proposé que seul le dimère de PLA2 du venin de serpent soit la forme active de l'enzyme.L'étude de la structure spatiale prouve également que le PLA2 du crotale à dos de diamant de l'Ouest existe sous forme de dimère.Composé piscivore
Il existe deux PLA différents ^ Ei et E2 de venin de serpent, dans lesquels 仏 existe sous forme de dimère, le dimère est actif et son monomère dissocié est inactif.Lu Yinghua et al.(1980) ont étudié plus en détail les propriétés physiques et chimiques et la cinétique de réaction de E. Jayanthi et al.(1989) ont isolé une PLA2 basique (VRVPL-V) du venin de vipère.Le poids moléculaire du monomère PLA2 est de 10000, ce qui a des effets létaux, anticoagulants et oedémateux.L'enzyme peut polymériser des polymères avec différents poids moléculaires dans des conditions de pH 4,8, et le degré de polymérisation et le poids moléculaire des polymères augmentent avec l'augmentation de la température.Le poids moléculaire du polymère généré à 96°C est de 53 100, et l'activité PLA2 de ce polymère augmente de deux
Heure de publication : 18 novembre 2022